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新葡萄8883官网AMG带你快速掌握Cre-LoxP系统的生物医疗应用

发布时间:2025-03-14   信息来源:尊龙凯时官方编辑

Cre-LoxP系统是一种基于位点特异性重组的基因编辑技术,由Cre重组酶和LoxP位点组合而成。Cre(Cyclization Recombination Enzyme)是一种由噬菌体P1产生的DNA重组酶,分子量为38kDa,由343个氨基酸构成。Cre能特异性识别LoxP位点的DNA序列,并介导LoxP位点之间的DNA重组。

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LoxP位点是一种34bp的序列,包含两个13bp的反向回文序列和一个8bp的中间序列。反向回文序列是Cre重组酶的结合位点,而中间序列则决定了LoxP的特异性。Cre-LoxP系统的主要优势在于其高效性和特异性,能够对活体动物实现精确的基因敲除、插入和翻转等操作。自20世纪80年代末被首次描述以来,该系统已广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建及神经科学研究等领域。

当基因中存在LoxP位点且有Cre重组酶时,Cre重组酶会识别LoxP位点的反向重复序列并结合形成二聚体。这些二聚体与其他LoxP位点的二聚体结合,形成四聚体,随后Cre重组酶切割LoxP位点之间的DNA序列,导致DNA断裂。通过DNA连接酶的作用,这些断裂的DNA端再次连接,从而完成重组过程。根据LoxP位点的方向和位置,Cre酶可以进行以下几种基因操作:

  • 删除:当两个LoxP位点在同一DNA片段的两端且方向相同时,Cre酶可以切除这两个LoxP位点之间的DNA片段。
  • 翻转:当两个LoxP位点在同一DNA片段的两端且方向相反时,Cre酶可以介导序列翻转。
  • 易位:若两个LoxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre酶会诱导发生易位。
  • 交换:如果四个LoxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre酶可诱导LoxP间的序列互换。

自Cre-LoxP系统问世以来,科学家们进行了多种优化,开发了LoxP位点的突变版本,如Lox2272、Lox511、Lox5171及LoxN等。这些变体表现出更高的识别和切割效率,能够在不同生物体中实现更复杂的基因重组。

LSL(LoxP-Stop-LoxP)系统是基于Cre-LoxP系统的一种条件性基因表达工具。它在目标基因上游插入被LoxP位点包围的终止盒。当Cre重组酶存在时,LoxP位点之间的DNA序列被切除,解除对目标基因的转录阻断,从而实现特定启动子驱动下的基因表达。

FLEX(Flip-Excision)系统通过在目标基因两侧设计不同方向或类型的LoxP位点,使Cre重组酶能先翻转基因片段方向,再切除特定序列,实现基因表达的双向调控。

DIO(Double-Floxed Inverted Orientation)系统是基于FLEX系统的优化版本。在DIO系统中,目标基因的开放阅读框反向排列并被LoxP和Lox2272位点包围。Cre重组酶的作用使得目标基因翻转,激活基因表达。

在DO(Double-Floxed Orientation)系统中,目标基因的开放阅读框正向排列,被LoxP和Lox2272位点包围。Cre重组酶的作用会翻转目标基因,使其与启动子方向不一致,从而抑制基因表达。由于LoxP和Lox2272位点互不兼容,重组后的基因无法再次翻转,实现稳定的基因抑制。

在转基因小鼠的研究中,利用Cre-LoxP系统的实现特定基因的敲除,取得了显著的实验成果。例如,研究人员在小鼠的特定外显子两侧插入同向的LoxP位点,通过病毒注射实现单侧特定基因的敲除。

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